Doktorsavhandling

 

Ännu en doktorsavhandling som delvis baseras på HoloMonitor. Delvis i så måtto att instrumentet fått utgöra basen tillsammans med ett annat instrument som kanske inte är så välkänt. Nämligen Fluidic Force Microscope (FluidFM). Wiki beskriver instrumentet såhär:

"Fluidic force microscopy (FluidFM) is a type of scanning probe microscopy, and is typically used on a standard inverted light microscope.

The unique characteristic of FluidFM is that it introduces microscopic channels into AFM probes. Those channels can have an aperture of less than 300 nm, or 500 times thinner than a human hair. This nanometric features enables the handling of liquid volumes at the femtoliter (fL) scale as well as force controlled manipulations of sub-micron objects. Via the nanofluidic channels, substances can for example be inserted into single cells or cells can be isolated from a confluent layer."

FluidFM och HoloMonitor är synnerligen användbara för single cell observations, vilket doktorsavhandlingen tar fasta på och även utvecklar ett resonemang kring.Jag kommer till det senare.

Avhandlingens kärna är studier kring HeLa celler,cancerceller. Eftersom många studier kring cancerceller kommer från HeLadito kan det vara på sin plats att utveckla vad HeLa är och dess historik.

Vi går till Wiki igen :

"HeLa-celler är celler som isolerats från en livmoderhalscancer och som används över hela världen vid cellbiologisk, virologisk, molekylärbiologisk inte minst medicinsk forskning. De var de första mänskliga celler från vilka en permanent odödlig cellinje skapats och som förökar sig obegränsat i en cellodling. De har fått sitt namn efter den 31-åriga patient, Henrietta Lacks, från vilken cellerna isolerades strax före hennes död år 1951. 

HeLa-cellen visade sig vara exceptionellt livskraftig och smittsam, så den har förorenat och konkurrerat ut många andra cellinjer så mycket forskning på föregivna celler som från fostervatten (WISH-cellinjen), lever och prostata har visat sig egentligen vara gjord på HeLa-celler, då ingen har kontrollerat cellinjernas äkthet. Detta avslöjades överraskande, kallat "HeLa-bomben", av den relativt okände forskaren Stanley Gartler på konferensen "Second Decenniel Review Conference on Cell Tissue and Organ Culture.

HeLa-cellerna själva har visat sig vara stabila, såvida de inte har smittats med framför allt virus eller utsatts för manipulation, vilket gett upphov till varianter som utvecklats allteftersom de odlats i cellodlingar världen över. Det har uppskattats att den totala massan av existerande HeLa-celler vida överstiger massan som resten av Henrietta Lacks kropp hade.

Kromosomerna i HeLa-celler är en kombination av mänskliga kromsomer och gener från det virus, humant papillomavirus (HPV 18)^[3] som orsakade cancern. Cellerna har multipla uppsättningar av vissa kromosomer så att det totala antalet uppgår till 82 jämfört med 46 i en normal mänsklig cell. Förslag har funnits att HeLa-cellerna borde betraktas som en egen art, Helacyton gartleri, i en egen familj, Helacytidae^[4].

HeLa-celler har haft och har fortfarande mycket stor betydelse för både naturvetenskaplig och medicinsk forskning, vilket framgår bland annat av att den medicinska databasen PubMed redovisar vid månadsskiftet maj/juni 2018 fler än 98 500 artiklar^[7].

Forskningen på HeLa cellerna ligger till grund för läkemedel mot bland annat herpes simplex, leukemi, hemofili, Parkinsons sjukdom och inte minst polio där arbetet med dem bidrog vid utvecklandet av vaccin. Slutsatser har även dragits gällande laktosomsättningen hos personer med laktosintolerans, och om hur olika miljöer och föroreningar påverkar celler."

Inom cancerforskningen kommer single cell observations bli allt vanligare då tekniken möjliggör mer konkret information visavi cancercellerna och deras utveckling, kontra dagens studier som handlar om studier på masspopulation av cancerceller. Fram till idag har tekniken att studera enskilda celler i en population varit ytterst begränsade. Minns vad chefen för amerikanska statliga NIH, Francis Collins, sa i en intervju 2019 betitlad :

10 ways medical innovation will transform our lives over the next decade

Som nr 1 angav Collins :  

1. Single cell analysis
Likely to be one of the first of the 10 breakthroughs to come to fruition, single-cell analysis will allow scientists to study individual cells in their normal environment for the first time. The ability to determine which genes are turned on or off in individual cells, and to decode how immune cells attack healthy tissue, will transform how we approach autoimmune diseases and how we combat the deadly process of cancer metastasis.

Den prognosen snappade VD Egelberg upp och kommenterade i detta inlägg : The Single-Cell Analysis Revolution Lund, January 2, 2020

Nåväl, 3 år senare har tekniken börjat få acceptans och användas då instrumenttillverkare lyssnat på forskare och börjat ta fram enklare sådana instrument. Märk väl att HoloMonitor dock är synnerligen med sin holoteknik lämpad till den typen av forskning. Men tillbaka till doktorsavhandlingen.

Den ungerskfödde f.d doktoranden Ágoston Gábor Nagy visar i sin avhandling att FluidFM tillsammans med HoloMonitor är mycket lämpade att använda vid single cells observations av HeLa-cancerceller.

Avhandlingen är betitlad :In vitro living cell studies on high-throughput nanofluidic force microscope (FluidFM) and phase holographic imaging

Från den väljer jag inledningsvis ut urval som berättar om HoloMonitor.

By utilizing holographic imaging, many features of cellular behavior can be defined, highlighting the instrument's capability and potential methodologies for drug development.

1.1.2. Digital holographic microscopy 

Cell adhesion, division real-time visualization of cellular movement and pharmaceutical affinity can be studied by emerging in vitro, label-free, high-throughput techniques 16–18,49–53. 

The digital holographic microscopy (DH) based Holomonitor M454–56 (HM) is one of the effective, label-free, realtime, and high-throughput instruments. It consists of a diode laser and a semi-transparent mirror that splits its beam into a reference and a sample beam. A mirror projects the sample beam to the observed cell culture. When the laser light goes through translucent objects (e.g., cells and layers), its phase will be shifted compared to the reference light because of the specific refractive index of the sample. The interference patterns created by the reference beam and the sample beam are recorded by an image sensor camera (Fig. 2.). Thus, the phase shift of the laser beam caused by cultured cells reconstructing the image of the sample is the detected signal. From this signal, it is possible to create 3D topographies of the objects in the laser’s path, because the thickness and refractive index of the cells have an effect on the phase shift of the laser light. The HM software visualizes the constructed images, and parameters related to the kinetics and morphologies of the cells can be obtained57 .

Figure 2. The image presents the path of the split laser in the M4 Holomonitor instrument. The sample beam passes through the cell, causing a phase shift, which is imprinted into the beam. The detection is based on this imprint and the interference with the reference beam. The image was reproduced from the Holomonitor M4 Setup and Operation Manual 58 .

An advantage of HM compared to other methods is that it enables experiments in a microfluidic environment, where cells are seeded into one well and chemokines into a different well, the two of which are connected with a microfluidic channel. Holomonitor M4 is an incubator-proof digital holography technique-based instrument51,59,60, which monitors cells in real-time in a humidified, temperature, and gas-controlled environment. Its main advantage is the real-time visualization, without any labeling or staining with cytofluorescent molecules, fixation, or any other substance, which could influence the microenvironment of the cells. Therefore, it is also cost-effective. In the experiment, samples containing cells are placed on the stage of the HM instrument. Cellular motion is recorded in 3D by focusing the microscope on the channel. No post-visualization is needed since cellular features  related to dynamics and morphology are computed in real-time. 

 

These instrumental abilities potentially allow automated detection of cancer cell invasion into compact monolayers, but such experiments have not been done yet. 

From the digital holography experiments, the phase shift (φ), the laser light wavelength (λ), the cell’s (nc=1.38), and the surrounding medium’s (nm=1.34) refractive index are the primary source of information to be used for the calculation of cell morphology parameters, such as thickness and optical volume. The cell area is calculated in the conventional way based on the number of occupied pixels. Parameters related to movement include the migration distance1 , motility and motility speed2 and migration directness3 . 

 

State-of-the-art of applications 

Since direct holographic microscopy enables long-term, label-free visualization and analysis of single-cells on a population level, a wide range of applications have already been demonstrated by imaging and monitoring the dynamics of living cells in different environments: in an incubator environment, hypoxia chamber, or directly on the lab bench. The most relevant applications are summarized in the following table (Table 4).

 

1.3.3. Investigation of cancer cell adhesion during invasion 

The invasion of cancer cells into epithelial monolayers is the first step in the metastatic cascade72; therefore, it is crucial to understand this process better where cancer cells detach themselves from the primary tumor, cross a cellular barrier and disseminate throughout the system. 

With the power and magnitude of the two instruments presented, the robotized FluidFM BOT/OMNIUM and the Holomonitor M4, it is possible to investigate the attachment of cancer cells to monolayers and their morphological and motility properties during cell invasion. 

The following objectives would describe novel approaches to study cancer cell invasion into epithelial monolayers: 1) Investigate single HeLa cancer cell attachment to confluent, epithelial Vero monolayer with FluidFM, in contrast to single Vero cell attachment in the same setting. 2) Propose a novel method with Holomonitor M4 to study the characteristics of morphological and motility parameters of HeLa cancer cell invasion into confluent, epithelial Vero monolayers. 

2.5. Observation of HeLa cancer cell invasion into epithelial Vero monolayer with Holomonitor 

The digital holographic microscopy-based Holomonitor M4 (HM) instrument is a versatile tool equipped with powerful software and a motorized xy-stage, which enables simultaneous recording of many wells located on a standard polystyrene tissue culture plate. The software of the HM records the phase shift of the specimen in given timepoints and calculates the specimens' (e.g., cells) morphological and motility parameters. In this context, the HM was applied to detect HeLa cancer cell invasiveness into a confluent monolayer of Vero cells seeded on a gelatin-coated dish (Fig. 25). Both the assembly of the Vero monolayer and the invasion of the HeLa cancer cells into the layer was monitored for 24 hours. It was observed that invasion can be characterized by HM based on the drop of morphology parameters (e.g., volume), due to the vanishing of the cancer cell invading the underlying monolayer. It was also found that there is a linear correlation between motility, the time of the invasion, and the speed of invasion. The results highlight the usability of HM for cancer cell invasion-related research since they show how invasive versus non-invasive cells behave on a confluent epithelial monolayer, which could help future investigations in drug development in a label-free and high-throughput manner.

 

Figure 25. Outline of the design, implementation and results of the holomonitor experiments. A) Vero cells (green) were seeded on the gelatin-coated petri dish. B) HeLa cells (red) were seeded on top of the self-assembled 100% confluent Vero monolayer (ML). C) Holomonitor M4 was used to image both monolayer assembly, and HeLa cell invasion for 24 hours. D) Illustrated expected result, the cancerous HeLa cells seeded on top of the epithelial Vero monolayer invade by searching for optimal infiltration positions. (Reproduced from Nagy et al, 2022140)

 

De som orkar traggla igenom hela avhandlingen och läsa avsnitten om f.d doktorarandens text om single cell observations vid HeLa cancercells studierna hittar många ganska uppseendeväckande partier. 

Jag klipper in en sammanfattning.

"These results highlight the robustness of these technologies, which can provide single-cell data in a high-throughput and precise manner. As it was shown in the Introduction, both of these techniques (FluidFM and PHI) have immense potential, enabling multiscale research and development."

Min kommentar

Denna doktorsavhandling kommer ge eko i forskarvärlden är min tro.F.d doktoranden men numera Dr
Ágoston Gábor Nagy visar här att han hittat,som han anser,de bästa sätten att med ny teknik via single cell observations forska fram nya läkemedel baserade på HeLa cancerceller. Det gängse sättet att utgå vid framtagning av nya läkemedel i dag,men då utan single cell observations som sagt. 

Kombon FluidFM + HoloMonitor visar han vara ett ypperligt instrument tillsammans med immense potential.  

Utöver läkemedelsframtagning är kombon naturligtvis högst användbar vid trad HeLa cancerforskning.

Den skarpögde noterar att Ágoston Gábor Nagy ingår i den HoloMonitorfrälste Robert Horvaths forskningsteam. Frågan är om inte PHI borde utse Robert Horvath till ambassadör för HoloMonitor,åtminstone i ÖstEuropa där hans team verkar. Med den förmåga Robert visar hur få ut så mycket av instrumentet är han otvivelaktigt en av de mest kompetenta bland användarna.

Använd bloggens sökfunktion för att hitta Roberts alla alster. 

 

                                           Mvh the99 

 

Som service till alla ev HoloMonitornyfikna forskare : PHIAB Webshop