Bloggen give you the very first scientific report from Russia containing PHI and the amazing HoloMonitor M4.
Jag är 99% säker på att detta är den första forskningsrapporten från Ryssland baserad på HoloMonitor.
Studien är utförd av 3 ryska forskare vid namn:
Синегубова Екатерина Олеговна, Дубровина И.А., Мясников В.А.
För de av er som inte kan läsa kyrilliska är de i tur och ordning:
Sinegubova Ekaterina Olegovna, Dubrovina I.A. och Myasnikov V.A.
Deras vetenskapliga rapport är betitlad :
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ РИБОСОМ-ИНАКТИВИРУЮЩИХ БЕЛКОВ НА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ IN VITRO
Och översatt blir det :
INTEGRATED APPROACH TO THE ESTIMATION OF CYTOTOXICITY OF RIBOSOM-INACTIVE PROTEINS ON A CELL MODEL IN VITRO
Studien är tillgänglig via CyberLeninka som wiki beskriver såhär :Russian scientific digital library, the largest legal research and educational resource of the Russian segment of the Internet
Forskarna utgår från statliga Federal State Budgetary Institution “State Research Testing Institute of Military Medicine” of the Ministry of Defense of the Russian Federation, 195043, St. Petersburg, Russia.
För 2 månader sen skrev bloggen om ett nytt högkvalitativt labb i Ryssland där HoloMonitor finns med i utrustningen.
Jag citerar ur det inlägget :
Detta labb är intressant av flera anledningar. Först att det är stort : Laboratorium 500 m 2 med modern utrustning
Innebär att det kanske finns hur många HoloMonitor installerade?
Sen att det ser ut att ingå i ett nav för rysk forskning ,Skolkovo Innovation Center, finansierad av ryska staten med x antal miljarder Skr.
43 miljarder rubel från 2010 till 2013 enligt wiki.Förmodligen minst lika mycket till, till dags datum.
Ryska staten ser ut att ha ambition att konkurrera med andra länders forskning då man satsar så kraftfullt. Förmodligen i PR-syfte till stor del. Men visar att de slantar upp hiskeliga summor för att med senaste tekniken visa omvärlden att även de är med i matchen. Statens repr för detta Center har identifierat HoloMonitor som en del i detta forskningsbygge. Kan man ana fler HoloMonitorinvesteringar framledes när de väl listat ut hur användbar tekniken är? Resurser finns.
Denna studie kan alltså vara den första baserad på M4 och utförd på labbet beskrivet i inlägget.
Den första studien utförd i statlig regi.
Men till innehållet i studien då.Google´s översättningsprogram hjälper till.Kan vara lite knagglig översättning emellanåt, men innehållet bör ändå framgå.
Anteckning av en vetenskaplig artikel om medicin och folkhälsa, författaren till ett vetenskapligt arbete är Sinegubova Ekaterina Olegovna, Dubrovina I.A., Myasnikov V.A.
Modern teknik inom molekylär och cellbiologi ger möjlighet att expandera kunskap inom olika vetenskapsområden. Så idag flyttar huvudfokus för farmakologin från hela organismer till celler och molekyler.
Sedan 80-talet av förra seklet syftar forskarna till att maximera
antalet djur och utveckla alternativa modeller och testsystem in vitro,
vilka är utformade för att ersätta de klassiska metoderna för att
studera farmakodynamik in vivo.
En särskild plats i modern forskning ägnas åt skapandet av
farmakologiska preparat med hög specificitetsverkan på celler eller
målmolekyler i kroppen.
Tanken att skapa ett läkemedel som selektivt kan påverka endast
atypiska celler och eliminera dem från kroppen fortsätter att vara
föremål för många studier.
Ur denna synvinkel studeras målriktad leverans av växtgiftningar, som
inaktiverar ribosomer, aktivt och därigenom fullständigt stoppar
proteinsyntesen i cellen. I det nuvarande arbetet användes viskumin , som används aktivt i antitumörterapi och används alltmer i detta område.
I artikeln betraktas som ett integrerat tillvägagångssätt två metoder för att bedöma cytotoxiciteten hos viscumin i in vitro-experiment på två cellinjer.
Det första mikrotetrazoliumtestet ( MTT
), som används som grund för bestämning av koncentrationen som orsakar
förlusten av livskraften hos 50% av cellerna (IC50), och den andra, som
inte använder kemiska etiketter, metoden för holografisk mikroskopi.
Abstrakt
Verkan av ett ämne som leder till kränkningar av en levande organisms funktioner definieras som giftig. Studien av ämnenas biologiska aktivitet i första etappen innebär en bedömning av deras toxicitet.
Detta gäller särskilt de läkemedelssubstanser som utvecklas, vars
forskning i prekliniska försök syftar till att säkerställa sin
fullständiga toxikologiska utvärdering.
Graden av användning av djur i försöksstudier ökade parallellt med utvecklingen av medicin och apotek.
Upptäckten av anestetika och publiceringen av Darwin om artens
ursprung, som bekräftar den biologiska likheten mellan människor och
djur, bidrog till den omfattande introduktionen av in vivo-experiment i
vetenskapen. Den ökande efterfrågan på högkvalitativa djurmodeller tillsammans med ett kritiskt öga på användningen ledde till utvecklingen av Three R-tekniken (reduktion), förfining (refinement) och ersättning (replacement)), som beskrivs i en bok som publicerades 1959 av två Forskare från Storbritannien, WMS Russell och Rex Burch, med titeln Principerna för human experimentell teknik. Denna teknik består i att förbättra protokollen och minska användningen av försöksdjur med deras efterföljande fullständiga ersättning med alternativa metoder.
Att uppmärksamma
I många länder i världen har användningen av djur i forskning lett till bildandet av en lagstiftningsbas, vars syfte är att lösa frågan om etiken för att utföra in vivo-experiment i detta speciella fall. Idag är begreppet "Three R" det mest relevanta inom området för vetenskaplig forskning vid planering och genomförande av experimentell forskning.
Cytotoxicitetsbedömningsmetoder är ett alternativ till de klassiska in vivo
toxicitetsbedömningstesterna.
In vitro-metoder som använder cellkulturer kan lösa både etiska problem som är förknippade med försöksdjurens död och signifikant minska tiden för preklinisk studie av nya kemikalier.
En annan fördel med cellmodeller är förmågan att arbeta direkt på mänskliga cellkulturer, vilket gör att data erhålls mer adekvata när de extrapoleras till hela organismen.
Basen för cellreaktionskomplexet, som tillhandahåller cellens primära anpassning till vilken stimulans som helst, inklusive det toxiska medlet, är baserat på enhetliga grundläggande mekanismer som orsakar liknande förändringar vid de molekylära och morfologiska nivåerna.
Detta gör lovande användningen av in vitro-modeller och standardtester för att bedöma cellens livskraft under påverkan av faktorer av olika natur.
En särskild plats i modern farmakologisk forskning ges till utveckling av fundamentalt nya metodologiska tillvägagångssätt.
Dov, liksom förbättringen av befintliga metoder för behandling av maligna tumörer.
De senaste årens resultat inom molekylär och cellulär biologi har identifierat de viktigaste anvisningarna för forskning om skapandet av nya cancermedicinska läkemedel. Många studier ägnas åt skapandet av farmakologiska läkemedel med hög specificitetsverkan på cellerna eller molekylerna i målet i kroppen. Det antas att sådana droger ska ha ett specifikt fokus, så att du selektivt kan förstöra tumörceller. En av de lovande utvecklingen på detta område kan vara ett system för riktad transport.
Som potentiella anticancerläkemedel studeras ribosominaktiverande proteiner (RIB), som fullständigt blockerar proteinsyntesen i cellen, aktivt. Deras utbredd användning inom detta område beror på att RIBs kan selektivt förstöra tumörceller och är mindre skadliga för normala celler.
Mistetotoxiska lektiner (Viscum album L.) hör till ribosominaktiverande proteiner, i vilka den enzymatiska A-kedjan (29kDa) är bunden med en disulfidbindning till lektin B-kedjan (34kDa), vilket ger penetration i cytosolen. A-subenhet av det specifika RNA-N-glykosidaset, som selektivt klyver adeninrest från det konserverade området av 28S ribosomalt RNA. En sådan ribosom kan inte längre binda förlängningsfaktorerna, vilket innefattar att stoppa translationsprocessen och följaktligen celldöd. Den exceptionella toxiciteten hos viskumin för mänskliga celler skapar förutsättningarna för dess användning för att skapa antitumörpreparat av riktningsverkan. Idag används mistletoextrakt (Viscum-album) allmänt i Europa för allmän immunostimulering vid cancer.
Således skapades förutsättningarna för utveckling av cytostatika på basis av RIB för behandling av autoimmuna och onkologiska sjukdomar, såväl som antivirala vacciner av den nya generationen.
En analys
Samspelet mellan ribosomaktiverande proteiner med målcellen, de giftiga processernas särdrag och olika morfologiska förändringar på cellulär nivå förbättrar kvaliteten på farmakologiska preparat baserat på dem och utvidgar tillämpningsområdet.
För att studera effekten av giftiga ämnen på cellkulturer används olika markörer för att bedöma graden av skada på vissa strukturer och mekanismer. Brott mot en vital funktion, som efter en viss tid har en negativ effekt på cellens livskraft, möjliggör en preliminär bedömning av graden av cytotoxicitet. Detta faktum underlättar uppgiften, eftersom det innebär, åtminstone vid det första utvärderingsstadiet, användningen av en begränsad uppsättning cellinjer (standard) samt ett litet antal test som utvärderar deras livskraft. Olika cellstrukturer i en multicellulär organism är så signifikant att känsligheten hos olika celler till toxiska ämnen kan skilja sig åt flera gånger. Men fortfarande kan vissa allmänna mekanismer som ligger bakom den cytotoxiska effekten identifieras. Diskussioner om energimetabolism, skador på cellmembran samt störning av proteinsyntes och proliferation tas traditionellt med i beräkningen. Men det är värt att notera att för att formulera sådana experiment krävs ett omfattande tillvägagångssätt. För det första utför test som utvärderar flera indikatorer på livskraft. För det andra användningen av flera cellinjer, med beaktande av de olika parametrarna för verkan av giftiga ämnen (varaktighet, dos).
Hittills kan de tester som används för att bedöma cytotoxicitet delas in i två grupper.
Grupp 1 innefattar användning av olika kemiska reagens som interagerar med vissa strukturer inuti eller utanför cellerna. De tillåter att bestämma graden av skada och exponeringspunkten för testämnet.
Den andra gruppen av test använder inte infärgning (etikettfri) och bedömningen av cytotoxicitet sker genom visualisering.
Metodik och Instrumentering
MTT spektrofotometer Tetrazolfärgämne mitokondriell enzymaktivitet
MTS, XTT, WST Spektrofotometer Tetrazol färgämne Mitokondriell enzymaktivitet
Annexin V-FITC / PI Flödescytometri Cytometrisk analys av apoptotisk celldöd
Bedömning av apoptos / cellnekros
Trypan Blåfärg Direkte cellantal Trypan blue
Bestämning av antalet levande celler
Neutral Red Absorption Neutral Red Spectrophotometer, absorberas och behålls endast av levande celler.
Utvärdering av transmembranöverföringsaktivitet, fagolysosomala funktioner
Realtidsmätning av resultat (celler lever):
Resazurin Fluorimetrisk metod Blåttfärg, som vid rekonstituering blir till rosa fluorescerande resorufin Mitokondriell enzymaktivitet
LDH-spektrofotometer Mätning av laktatdehydrogenasaktivitet närvarande i cytoplasma hos levande celler och släppt in i mediet genom membranskada
Utan att använda infärgning (etikettfri)
Holografisk mikroskopi Holomonitor M4 Xcelligence ACEA Holografisk mikroskop, detektering och inspelningssystem Mikroskopi Utvärdering av cellmorfologiska förändringar
Impedansmätning Icke-invasiv elektrisk impedansövervakning för att kvantifiera cellproliferation, realtids morfologiska förändringar Bedömning av cellmorfologiska förändringar
och direkt detektering av viktiga indikatorer för celllönsamhet.
I vår studie utvärderade vi inom ramen för ett integrerat tillvägagångssätt två metoder för att upptäcka effekten av ett ämne på mobilnivån. Det första är ett kolorimetriskt test för att bedöma den metaboliska aktiviteten hos celler, känd som mikrotetrazoliumtestet (MTT).
Den andra, relativt nya metoden, som ännu inte har hittat bred tillämpning övning, holografisk mikroskopi, vilket innebär att man skapar en holografisk bild av ett objekt med Holomonitor M4. Denna anordning möjliggör visualisering av ett cellmonoskikt in vivo, vilket gör det unikt för studier på cellkulturer.
För att bedöma den cytotoxiska effekten av v-scumin på de morfologiska egenskaperna hos cellerna användes holografisk mikroskopi.
Denna metod gör det möjligt att visualisera ett cellmonolag in vivo och spela in förändringar med hjälp av Holomonitor M4-instrumentet (Holomonitor M4-instrument, fasholografisk bildbehandling PHI AB, Sverige).
Celler odlades i en mängd av 0,7 x 106 (S 25 cm2) i ampuller i DMEM-medium innehållande 10% FBS, 48-72 timmar efter plantering av cellerna, varvid den erforderliga sammanflödet av monoskiktet uppnåddes (70-80%). Därefter byttes DMEM näringsmediet till serumfritt med viscumin och inom 24 timmar detekterades de morfologiska förändringarna av cellerna under påverkan av testämnet.
Därefter utvärderades de morfologiska förändringarna av cellerna med användning av mjukvaran tillhandahållen av tillverkaren av Holografiska Imaging PHI AB.
Fig 1.
Den cytotoxiska effekten av viskumin på A-549-cellodling med 24 h inkubation.
För att bedöma den cytotoxiska effekten användes ett test för att återställa MTT till MTT-f.
att koncentrationen som orsakar förlust av livskraften hos 50% av cellerna (1C50) är 0,002 ± 0,00005 μg / ml. På grundval av de erhållna data genomfördes ett experiment för att studera de morfologiska förändringarna av celler när de utsattes för dem med en testämne vid en lämplig koncentration av 1C.
Bestämning av morfologiska förändringar av cellmonolagret i kontrollgruppen och under behandling med viscumin
Cellernas morfologi och deras antal är viktiga parametrar vid analys av substansens cytotoxiska effekt. Med hjälp av holografisk mikroskopi (Holomonitor M4) registrerades de morfologiska förändringarna av HEK293-cellerna i kontrollgruppen och vid behandling med viscumin i en koncentration av 0,002 μg / ml.
Levande celler är oregelbundna, plana och fästa på odlingsskålens yta. Skadade celler är mer enhetliga i form, avlägsnande från substratet och reduktion av ytan uppträder, celler flyter i odlingsmediet. Huvudparametrarna för att bestämma effekten av giftiga ämnen på cellpopulationer med hjälp av holografisk mikroskopi, vilket möjliggör visualisering av cellmonolaget, är morpotypparametrar.
Fig 2.
Dynamik av cellmonolagbildning i kontrollgruppen.
2 visar monoskiktet (a) vid odlingens början och efter 24 timmar (b). Såsom kan ses i denna figur är cellerna i början av odlingen utplattade och fästa på substratet och täcker en liten del av odlingsrätten (sammanflöde av 23%). Efter 24 timmars odling når monolagskonfluensen 56%.
När man studerar förändringar i cellernas morfologi med hjälp av holografisk mikroskopi är den otvivelaktiga fördelen möjligheten att visualisera in vivo förändringar som sker utan påverkan av giftiga ämnen. För att detektera förändringar i cellens morfologiska struktur under påverkan av det förmodade toxiska medlet odlades cellerna i 24 timmar med DMEM-medium och tillsatsen av 10% FBS, varefter mediet ersattes.
Fig 3.
Holografisk visualisering av cellmonolag HEK293 behandlat med viskumin i 24 timmar.
På serumfri med tillsats av viskumin i en koncentration av 0,002 μg / ml. Därefter inspelades inom 24 timmar visuella förändringar av cellmonolaget med användning av Holomonitor M4-instrumentet. Den morfologiska strukturen hos cellerna genomgår förändringar i förhållande till kontrollgruppen redan efter 6 timmars inkubation, medan man vid utvärdering av cytotoxicitet med användning av MTT uppträdde statistiskt signifikanta skillnader mellan försöks- och kontrollgrupperna endast 24 timmar efter start av ämnesexponeringen. Detta kan bero på att när man bedömer den totala aktiviteten hos mitokondriella dehydrogenaser (MTT-test) i de tidiga stadierna, saknas signifikant minskning av aktiviteten av cellulär andning, medan de morfologiska förändringarna som är karakteristiska för början av celldödsprocessen redan är synliga.
I fig. 3 visar holografiska bilder och scatterplots av HEK293 cellinjen efter direkt behandling med viskumin och efter 12 och 24 timmars inkubation. Holografiska bilder (vänster kolumn) visar att när de utsätts för viskumin i en koncentration av 0,002 μg / ml, ökar enskilda celler i storlek, blir mer likformiga och börjar lossna från botten av odlingskolven. På scatterdiagrammet (längs abscissaaxeln - oregelbundenhet, längs ordinataxelns tjocklek) observeras dynamiken hos celllinjens morfologiska förändringar under påverkan av testämnet. Med hjälp av gating isolerades en zon av döda celler (orange), en zon av platta celler med en oregelbunden struktur (lila), vilket motsvarar levande celler och ett litet antal heterogena och förstorade celler (blå) isolerades. Efter 24 timmar minskade cellmonolaget i området och cellmorfologin genomgick signifikanta förändringar, i synnerhet blev de döende stålen mer enhetliga och ökade i tjocklek.
Slutsats
Urval av grundläggande test för studier av cytotoxicitet är ett viktigt steg vid planering av toxikologiska studier.
Brazen är ett integrerat tillvägagångssätt som består av ett "batteri" av test med eller utan användning av kemiska reagenser, inklusive flera indikatorer på livskraft, uppsättningar av grödor och olika perioder av exponering för misstänkta giftiga ämnen.
En bedömning gjordes av två metoder för att detektera toxiciteten hos viscumin.
MTT-testet fick oss att bestämma arbetskoncentrationer av ett ämne för den efterföljande mer djupgående studien av dess toxicitet vid in vitro-experiment, medan användningen av den holografiska mikroskopi-metoden gjorde effekterna av läkemedlet synligt tidigare.
Användningen av två olika tillvägagångssätt för bedömningen av cytotoxicitet gjorde det möjligt för oss att omedelbart bestämma flera indikatorer som karakteriserar cellmaterialets livskraft, vilket gjorde det möjligt att mer noggrant bedöma omfattningen av de skadliga effekterna av viskumin.
Trots svårigheterna vid tolkning av data är testmetoderna för in vitro cytotoxicitet mycket användbara på grund av deras enkelhet och ekonomiska fördelar och kan användas som screeningsmetoder för separation av farmakologiska ämnen vid ett tidigt stadium av studier och identifiering av de cellulära och molekylära mekanismerna för deras biologiska aktivitet.
Min kommentar
Denna artikel dök upp i min nätsökning i gårkväll. Den var alldeles för intressant att lägga undan och bearbeta senare då den som sagt är den allra första (99% säker) studien utförd i Ryssland, med ryska forskare, och i statlig regi. Därav detta sena inlägg. Som jag skrev i Marsinlägget : Kan man ana fler HoloMonitorinvesteringar framledes när de väl listat ut hur användbar tekniken är? Resurser finns.
Är vallen nu bruten med denna premiärstudie och den ryska björnen på G att använda HoloMonitor i fler sammanhang? Att dessa 3 ryska forskare var förtjusta i instrumentet tror jag framgår mellan raderna.
Ni noterar väl att de inledningsvis berörde djurförsök och lagstiftning mot det?
De har identifierat alternativet.
Подними Россию
Mvh the99
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar