Poster på kommande AACR Event

Eliminating Edge Effect in 96-Well Plates by Controlling Thermal Conditions during Cell Plating

Presenter/Authors

Shannon Darou¹, Alicia Henn¹, Kersti Alm², Allayna M. Frank¹, Randy Yerden³. ¹BioSpherix, Ltd., Parish, NY; ²Phase Holographic Imaging, Inc PHI AB, Lund, Sweden; ³Randy Yerden, Parish, NY

Disclosures

  S. Darou: ; BioSpherix. A. Henn: ; BioSpherix. K. Alm: ; PHI AB. A.M. Frank: ; BioSpherix, Ltd. R. Yerden: ; BioSpherix.

 

Abstract

The traditional approach to avoiding the increased variability in 96-well plate edge wells has been to avoid using them. 

This results in a 37% loss in usable assay space, increasing time and materials needed for cell-based assays. 

Approaches to reducing this “edge effect” have included reducing plate evaporation during long-term incubation. 

However, we have preliminary data that plating cells at a constant 37 degrees C dramatically reduces edge effect. 

We have previously showed that in plates filled at room temp (RT), the cells in edge and corner wells experienced the most directional cell rolling during cell settling, preventing random cell deposition. 

In contrast, cells plated at 37 degrees C settled randomly in edge wells with less or no directional rolling. 

Here, we extend these findings with studies of well-specific cell settling patterns associated with plate-wide thermal changes after cell plating. 

Our null hypothesis was that intra-well thermal currents as plates warm to 37 degrees C from RT do not disrupt random cell deposition during settling. 

A549 human lung carcinoma cells were plated in warmed medium in either traditional uncontrolled RT conditions or in an Xvivo System under completely controllable conditions. 

In this closed chamber, everything (chamber floor, atmosphere, the pipettor, tips, fluids, gloves, and plate) was at the same temp as the incubator, where cells typically settle in the wells after plating. 

We used the PHI HoloMonitor M4 microscope to record holographic time-lapse images of cells settling and adhering to the well floor. 

Crystal violet staining was used to assess cell deposition patterns.

We found that not only did constant temp conditions change well-specific cell settling patterns, but when plate-wide thermal changes were inverted, by plating cells at 37 degrees C and letting them settle at RT, we were able to alter well-specific cell rolling and cell settling patterns. 

We concluded that it is thermal changes that drive edge well variability and that constant temperature control during cell plating can reduce or eliminate edge effect. 

Plating cells under full-time control of conditions could have a tremendous impact on cell-based drug discovery and pre-clinical testing by allowing full use of 96-well plates. 

This could reduce assay time and materials as well as improve assay reproducibility.

(Fetningar och understryk i texten är bloggens egna)

Min kommentar

Vad denna text betyder på begriplig svenska och dess innebörd tror jag mig fått kläm på.

Men obs, undertecknad är ingen labbare utan vanlig lekman så vill man ha en 100% korrekt tolkning får man vända sig till nån som sysslar med labbande.

Ok, here it goes.

Vid en första anblick på postern låter det inte så värst upphetsande. Cellodlingskärl ?!?

Hur intressant är det egentligen? Jo,väldigt intressant. Inte bara för gemene forskare/användare.

I ett större perspektiv blir det inte bara intressant utan även riktigt spännande. 

Texten berättar om ett väl känt problem och irritationsmoment bland forskarkåren. 
Man beskriver det bra i den inledande meningen:  "Det traditionella sättet att undvika variatoner i en 96 brunnars cellodlingsplatta är att undvika att använda dem."
Med variatoner menar man skillnader i temperatur och luftfuktighet mellan samtliga 96 brunnar. 
En forskare måste kunna lita på att förutsättningarna är 100% lika när han gör cellodlingar i en cellodlingsplatta, oavsett om det är en 6-12-24-48-96 brunnars platta.
Brunn 1 som brunn 6 i en 6-odlingsplatta måste ha samma "conditions" villkor/förutsättning när forskaren startar sina studier. Minsta diff på temp eller fukt mellan brunnarna gör studierna värdelösa. Är materialet / celler man ska använda begränsat får det katastrofalt resultat om skillnader i "conditions" upptäcks. 
Detta är varje forskares mardröm.
Just forskning med en 96-brunnars platta är den vanligaste enligt Wiki.
"The most common microplate format used in academic research laboratories or clinical diagnostic laboratories is 96-well".

Kollar man på nätet där forskare "hänger" ventileras just användande av 96 plattan.

How do cells grow uneven in a 96 well plate? Please suggest a solution for this.

In a 96 well plate, the top most line of cells will grow very slowly but in middle lines cells grow faster compared to top and because of that my assays are erroneous. Please help me to solve that.

Svar från en mer erfaren forskarkollega :

96-well plates are known to have evaporation problems especially the the perimeter wells. It is a phenomenon refereed to as the edge effect. The longer the cells are grown for the more pronounced will be the effect (more than 24 h). As media evaporate faster in these perimeter wells, the composition of the media is altered therefore altering cells growth rate.

To solve this problem different things have been suggested:

- Avoiding them;

I have a problem maintaining consistent media volumes in my 96-well plates. Any suggestions?

Answer

Absolutely. This is a common problem faced by 96-well plate users referred to as Edge Effect. The uneven evaporation of media in wells within the 96-well plate, especially in the outer most wells is due to uneven heating and insulation of the plate when stacked.

Fortsätter vi läsa postern får vi info att 37% av en 96 brunnars platta inte används (36 brunnar för att vara exakt) för risken med fluktuationer. Handlar alltså om "kanteffekten". 

Man använder inte brunnarna som omsluter plattan. Yttrar sig såhär :

En forskare från Thermo Fisher beskriver problematiken väl:

Cell-based assays are an integral component of a variety of research applications. Creating a homogenous environment for cell cultures is critical to ensure consistent and repeatable results, but this environment can be difficult to achieve, particularly when applications require long incubation times.
One significant challenge to the development of homogenous cell culture environments is the edge effect. The edge effect refers to a pair of related problems: differential temperature distribution across plates and differential evaporation between wells.

Temperature gradients during sedimentation of cells can result in uneven cell seeding and reduced consistency in results. Evaporation occurs across entire plates, but tends to have a greater effect on the outer wells. This causes cell viability problems; if too much media evaporates, pH and osmolality change the conditions of cell development and reduce cell viability. For a 96-well plate, this means that 36 wells are rendered unusable.

The most popular solution to mitigate the edge effect has been leaving the outer 36 wells empty or filling them with sterile water. This successfully reduces temperature gradient and evaporation, but it also effectively decreases plate size by 37.5 percent. Such a reduction necessitates more plates, more incubator space, and more time – something which causes a decrease in efficiency and productivity.

För att knyta ihop säcken då.
Först. Såhär ser PHI,s 96 brunnsplatta HoloLid 96 ut

Denna platta tillsammans med en HoloMonitor inne i en BioSpherix inkubator har man nu optimerat ihop för att lösa den beryktade kanteffekten.
Jag är 99,9% säker på att man använt HoloLid 96 plattan i testerna då den plattan är utformad för att passa i HoloMonitorns motordrivna bord. Motordrivet för att man ska kunna studera varje brunn inne i inkubatorn utan att bryta luft resp fukt kedjan genom att ta ut plattan och följa utveckling i rumstemp. 
Bekräftelse på det får vi i postern : Approaches to reducing this “edge effect” have included reducing plate evaporation during long-term incubation.
HoloMonitor kopplas upp till datorer och medger följning utanför inkubatorn, men det visste ni förmodligen.
Hursom.
Resultatet beskriver man enligt följande :
Plating cells under full-time control of conditions could have a tremendous impact on cell-based drug discovery and pre-clinical testing by allowing full use of 96-well plates. 
This could reduce assay time and materials as well as improve assay reproducibility.

"Tremendous impact on cellbased drug discovery and pre-clinical testing..." 
Smaka på den meningen.
Och
"This could reduce assay time and materials as well as improve assay reproducibility."



Vad denna poster berättar är att man löst problemet forskarna har med kanteffekt.
Det den desto mer vibbar om är att denna kombo är ypperlig för Big Data.
10 HoloMonitrar i ett/flera inkubatorsystem där varje 96-platta representerar en specifik studie.
Långtidsstudier i ett helt slutet inkubatorsystem där inga störningsmoment som temp eller fukt variationer uppstår som kan påverka slutresultatet = Big Data optimalt.
Tänk den tanken.
Och slutligen en riktig bonuseffekt till enskilda forskare och för den delen även behandlande läkare?.
Ladda 96 brunnar med patients cancerceller, addera befintliga läkemedel i varje brunn, "lås" in i ett slutet inkubatorsystem med en HoloMonitor, långtidsstudera och följ utveckling via dator, få svar på vilket läkemedel eller mix av läkemedel som ger bäst effekt på cancern.
Patientens överlevnadsmöjlighet ökar med hur många % ?
(Detta förfaringssätt lirar bra mot det Australiensiska fenomenet 
Translational Research Institute hur de bedriver sin verksamhet. Länk 1 & Länk 2.)

Ska vi gissa att denna Biospherix/PHI poster kommer få uppmärksamhet på Eventet?

Avslutningsvis. Notera att BioSpherix grundare Randy Yerden valt att stå med i postern.
Vibb om...?
                                  Ha en trevlig kvällsläsning önskar the99