Doktorsavhandling (med spets) från Tyskland

F.d doktoranden Elias Bekka har kvitterat ut sin doktorshatt och examen med sin avhandling :

Zur Toxizität der chromodiagnostischen Farbstoffe Methylenblau, Toluidinblau und Indigokarmin in vitro

Disputationen skedde via Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und ToxikologieInstitut der Ludwig-Maximilians-Universität München

Institutet riktar in sin forskning på toxikologi,alltså forskning om giftiga ämnen och deras inverkan på levande organismer.

Avhandlingen är dessvärre på tyska och mina tyskakunskaper är inte riktigt up-to-date fast jag pluggat språket 6 år.Tyska medicinska termer fanns inte på schemat när undertecknad så flitigt pluggade glosor.

Men Mr Google hjälper till inledningsvis och berättar att avhandlingen tar sitt avstamp ur en serie händelser från 2008 och 2010. 27 hjärtpatienter fick allvarliga komplikationer efter ha injicerats med färgämnen (godkända och vedertagna) i syfte att lokalisera resp patients hjärtproblematik.

Jämför markörer cancerpatienter får i samma syfte,att lokalisera ev tumörer och cancerceller invärtes.

Undertecknad har erfarenhet av detta och fått förklarat det som att markörerna innehåller ämnen som markerar träff vid detekterad tumör eller cancerceller. Jag går inte in djupare på vad för ämnen dessa 27 olycksaliga injicerades med,men enligt texten var det någon typ av färgämnen.

Dödsfall inträffade som konsekvens och doktoranden försöker här visa på anledning.

1 Einleitung

 
1.1 Lebensbedrohliche Kreislaufreaktionen nach intravenöser Farbstoffinjektion zur Chromodiagnostik

Im Juli 2008 berichtete die Arzneimittelkommission der deutschen Ärzteschaft (AkdÄ) über 5 Fälle von lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen bis zur Entwicklung von Kammerflimmern oder einer Asystolie nach intravenöser Anwendung von Toluidinblau (TB) [1]. Bis 2010 lagen 22 gemeldete Fälle der AkdÄ vor [2], parallel hierzu wurden zwei Fallberichte von Herzrhythmusstörungen nach TB Applikation publiziert. In dem Fallbericht von Radke et al. [3] wurde einer Patientin zur Behebung einer Prilocain-induzierten Methämoglobinämie 300 mg TB intravenös appliziert. Wenige Minuten danach klagte die Patientin über zunehmende Dyspnoe, trübte ein und entwickelte ein Kammerflimmern, welches durch eine Defibrillation terminiert werden konnte. Zieger et al. [4] berichten über eine ventrikuläre Tachykardie mit Übergang in Kammerflimmern unmittelbar nach der Gabe von 150-180 mg TB. Eine umgehend eingeleitete Reanimation mit Defibrillation zeigte sich auch hier erfolgreich. Aus dem Bericht der AkdÄ geht hervor, dass sich die meisten Herzrhythmusstörungen nach kurzzeitigen Reanimationsmaßnahmen zurückbildeten. Laut der Arzneimittelkommission starb ein bereits schwer vorerkrankter Patient zwei Tage nach dem Ereignis [1], weitere Todesfälle sind in der Literatur nicht beschrieben. 

Wie konnte es zu dieser Häufung von schweren kardiovaskulären Komplikationen kommen? In Deutschland waren zum Zeitpunkt des Auftretens der Komplikationen zwei andere Farbstoffe im Gebrauch, deren Verfügbarkeit jedoch im Rahmen von Lieferengpässen und Reinheitsproblemen bei der Herstellung zum Ausweichen auf TB führten: Methylenblau (MB) und Indigokarmin (IK) [5]. Ersteres gehört als Intravitalfarbstoff wie TB zu den Phenothiazinfarbstoffen, das letztere ist ein sogenannter Supravitalfarbstoff aus der Gruppe der Indol- bzw Isatinfarbstoffe. TB stellte in diesem Zeitraum einen nützlichen alternativen Farbstoffindikator in der Chromodiagnostik dar. Seine tiefblaue Farbe machten dieses Molekül zu einem wertvollen Hilfsmittel in der Urologie und Gynäkologie, aber auch im Bereich der Kinderchirurgie.....

Den som vill veta hur Elias Bekka utförde sina studier och hur han kom till sina slutsatser och svar på hur vedertagna färgämnen fick så olycksaliga förlopp rekommenderar jag att läsa hans 105 sidiga avhandling.

Till hans hjälp ställdes ett instrument från Sverige till förfogande.

Jag klipper ur det mest intressanta för oss phi,are.

2.4 Testmethoden 

2.4.1 Morphologische Voruntersuchungen am digital holographischen Mikroskop (Holomonitor) 

Die digitale holographische Mikroskopie ist eine nicht-invasive bildgebende Methode zur quantitativen Beurteilung der Zellmorphologie. Ein einfallender monochromatischer Lichtstrahl wird in einen Referenzlichtstrahl und einen Objektlichtstrahl geteilt. Der Referenzlichtstrahl wird am Objekt vorbeigeleitet, während der Objektlichstrahl auf das Objekt einfällt. Die vom Objekt  ausgehende Wellenfront wird fokussiert und interferiert mit dem Referenzlichtstrahl. Aus diesem Interferenzmuster wird computergestützt ein dreidimensionales Bild des Objekts rekonstruiert [92]. Es wurden wie in 2.5.2 beschrieben, L929 und A549 Zellen auf 6-Well-Platten ausgesät. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen wurden mit TB und MB Lösungen unterschiedlicher Konzentration 20 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen am Holomonitor morphologisch untersucht.

3.1 Morphologische Veränderungen unter Farbstoffeinfluss Nach 20-stündiger Farbstoffexposition stellte man am Holomonitor eine generalisierte Zellschwellung fest, sowohl qualitativ auf den digital produzierten Bildern als auch quantitativ anhand einer signifikanten Zunahme der gemessenen Zellgröße in farbstoffexponierten Zellen. Dabei führten beide Farbstoffe zu einer signifikant vermehrten Zellschwellung im Vergleich zu Kontrollen und TB führte in einer Dosierung von 500 µM zu einer signifikant stärkeren Zunahme der Zellgröße als MB in derselben Dosierung.

 

Abb 3.1 Digital rekonstruierte Bilder von Kontroll- und Toluidinblauexponierten L929 Zellen aus holographischer Mikroskopie: Links: Kontrollzellen, nach 20-stündiger Exposition mit reinem HBSS. Rechts: Zellen nach 20-stündiger Exposition mit 50 µM Toluidinblau gelöst in HBSS.

Abb 3.2 Größenzunahme von A549 und L929 Zellen nach Phenothiazin Farbstoffexposition: Holographische Messung der Zellerhabenheit. Man erkennt eine signifikante Zellschwellung in beiden Zelllinien bei allen eingesetzten Konzentrationen. Dargestellt sind die Mittelwerte der Zellgrößen von über 500 Zellen im Rahmen eines Versuchs (20-stündige Methylenblau (MB) und Toluidinblau (TB) Exposition).

4.7.2 Qualität der Zellfraktionierung

Eine weitere Schwierigkeit bot der Störeinfluss der Farbstoffe auf sämtliche spektrophotometrische Methoden aufgrund überlappender Absorptionsspektra. Hierfür wurden ungefärbte Zellen für die Beurteilung der Fraktionierungsqualität zusätzlich zu den farbstoffexponierten Zellen nach demselben Protokoll aufgearbeitet. Da Versuche am Holomonitor zeigten, dass MB und TB erst nach 20 Stunden zu einer ausgeprägten Schwellung der Zellen in Vergleich zu nicht exponierten Zellen führte, konnte nicht ausgeschlossen
werden, dass die intrazelluläre Organellverteilung in Farbstoff-exponierten Zellen erhalten blieb. Dem wurde versucht entgegenzuwirken, indem kürzere Farbstoffexpositionen (2 Stunden) für die Zellfraktionierungsversuche ausgewählt wurden.
Zusammenfassend erlaubte die Zellfraktionierung eine ungefähre Auftrennung der Kompartimente: eine mitochondriale, kernhaltige, Plasmamembran- und zytosolische Fraktion. Diese Auftrennung diente einer groben Sondierung der subzellulären Verteilung der Farbstoffe.

Googleöversättning av sista stycket :

En annan svårighet var interferensen av färgämnena på alla spektrofotometriska metoder på grund av överlappning absorptionsspektra. För detta ändamål bearbetades ofärgade celler för bedömning av fraktioneringskvaliteten förutom de färgämnesexponerade cellerna enligt samma protokoll. 

Eftersom experiment på holomonitorn visade att MB och TB endast ledde till uttalad svullnad av cellerna efter 20 timmar jämfört med icke-exponerade celler, kunde detta inte uteslutas visade att den intracellulära organellfördelningen bevarades i färgämnesexponerade celler. Ett försök gjordes att motverka detta genom att välja kortare färgexponeringar (2 timmar) för cellfraktioneringsexperimenten. Sammanfattningsvis möjliggjorde cellfraktioneringen en ungefärlig separation av avdelningarna: en mitokondriell, kärnbildad, plasmamembran och cytosolfraktion. Denna separation tjänade till att grovt undersöka den subcellulära fördelningen av färgämnena.

 

Min kommentar

Denna avhandling är rena kriminalgåtan där Elias Bekka (förmodligen) löser ett mysterium som gäckat tyska forskare och läkare lång tid.Som jag tolkar det har han extremt mödosamt exponerat adekvata celler (massvis med sådana) med de då rådande färgämnen.Sen har han studerat varje infärgad cell under olika tidsförlopp (time lapse via HoloMonitor) för att se reaktion.Mest troligt har han korskört ett flertal infärgace celler och den vägen kunnat visa på varför resp hjärtpatient drabbats av komplikationer (dödsfall).

Min subjektiva åsikt är att Elias genomfört ett extremt ambitiöst studiearbete och förhoppningsvis belönas med en doktorshatt av allra finaste snitt.Att HoloMonitor är användbar för rent medicinskt detektivarbete är maffigt. 

PHI borde rama in denna doktorsavhandling på sin hemsida.

 

                                               Mvh the99   

Ps. Phi-grävare Oscar har mejlat över en ny forskningsrapport från GlycoImaging-gänget under ledning av Anette Gjörloff-Wingren.Jag tänkte ge Oscar möjligheten att göra en sammanfattning för att sen publicera den. 

(Ingen press Oscar,vi alla phi,are väntar förväntansfullt) 😎😎😎